Uso de la fluorescencia clorofílica como indicador de estrés por altas temperaturas en plantas frutales.
1. La fluorescencia clorofílica como parte del proceso fotoquímico.
1.1. La fotosíntesis y la fluorescencia clorofílica.
La absorción de luz para la realización de fotosíntesis por parte de los organismos autotróficos fotosintéticos es llevada a cabo por los complejos pigmento-proteínas cosechadores de luz (LHCs., por su sigla en inglés), los que están asociados a los centros de reacción de los foto-sistemas (Müller et al., 2001). Los LHCs. están embebidos en la membrana del tilacoide en las plantas verdes, las algas y las cianobacterias; la separación de carga y el transporte de electrones secundario para la realización fotoquímica (fotosíntesis) se realiza en el centro de reacción (RC) del fotosistema II (PSII). Los centros de reacción están rodeados por proteínas del centro de antenas, las que capturan y reparten la luz absorbida por las moléculas de clorofila a los centros de reacción de manera eficiente (Andrizhiyevskaya et al., 2005).
La energía que reciben las moléculas de clorofila a partir de la luz solar, puede distribuirse por 3 diferentes vías: esta puede ser usada para la realización de fotosíntesis por el vegetal (fotoquímica), las otras vías pueden ser la disipación por calor, o puede ser re-emitida como luz (fluorescencia clorofílica), estas últimas ocurren cuando hay un exceso de energía luminosa (Maxwell y Johnson, 2000), o cuando el aparato fotosintético sufre algún tipo de daño por estrés. Müller et al. (2001) señala que existe una alternativa extra, indicada como un proceso no fotoquímico mediante la formación de un estado de triplete de la molécula de clorofila (Chl*), el cual se encarga de producir una especie oxigénica reactiva (O2*), que se constituye en una especie altamente dañina para el aparato fotosintético (Foto-oxidación).
Por lo anterior se puede mencionar que las vías de disipación de energía antes mencionadas (fotosíntesis, emisión de calor, emisión de fluorescencia y formación de tripletes) ocurren en competencia, y un aumento en uno de ellos lleva a una disminución en cualquier otro. Lo que ya deja de manifiesto que, desde un cierto nivel, la fotosíntesis y la fluorescencia clorofílica son procesos antagónicos.
Según Maxwell y Johnson (2000), la ventaja que presenta utilizar la medición de fluorescencia clorofílica para estimar la fotosíntesis en relación al método que se basa en la fijación de CO2, es que esta indica el funcionamiento del fotosistema II como punto crítico de la fotosíntesis, mientras que la absorción de CO2, no es tan representativa, porque este proceso compite con muchos otros y su estimación es muy sesgada.
1.2. El origen de la fluorescencia clorofílica.
Como se mencionó anteriormente, durante la fotosíntesis los fotones (partículas de luz) provenientes de la energía solar son absorbidos por complejos sistemas denominados pigmentos antena, los cuales se encargan de capturar y de canalizar la energía para el funcionamiento fotoquímico de los vegetales.
El fotosistema II ha sido señalado por mucho tiempo como el eslabón clave más débil, y como el principal artífice de la fluorescencia clorofílica, pero el daño en el fotosistema II sólo ocurre a altas temperaturas, generalmente sobre los 45ºC (Sharkey, 2005). De hecho Ducruet et al. (2007) señala que el fotosistema II es el único con una capacidad de realizar fluorescencia variable, y su rendimiento en fluorescencia depende de 2 formas de procesos de disipación de energía, el proceso de disipación fotoquímico (fotosíntesis) y los procesos de disipación no fotoquímica (emisión de calor, fluorescencia y formación de tripletes). Por lo tanto, la fluorescencia clorofílica ocurre a nivel del fotosistema II.
1.3. La fluorescencia como vía de disipación de energía.
Como se señaló anteriormente la fluorescencia clorofílica es una de las vías mediante la cual los vegetales disipan energía, el espectro de absorción de luz es por lo tanto diferente al espectro de fluorescencia. Sharkey (2005) señala que la emisión de fluorescencia debido al desacople del fotosistema II, es una manera de evitar dañar todo el sistema de reacciones en cascada posterior, que se produce una vez que la plastoquinona QA acepta los electrones de la fotólisis del agua, meditado por la energía solar absorbida por las clorofilas. Esto, debido a lo que señala Müller et al. (2001), ya que al no generarse este freno se producirían especies oxigénicas con un poder de daño muy elevado, capaces de dañar de manera irreversible todo el aparataje celular, comprometiendo con ello la homeostasis, y la vida de la planta. Por tanto dentro de un evento de estrés por calor, para cualquier planta, es mucho más económico, desde un punto de vista fisiológico, desacoplar el sistema, que volver a generar las estructuras dañadas y detoxificar las especies oxigénicas reactivas. Para Allakhverdiev et al. (2008) esto es muy importante porque el daño generado por el estrés se puede deber a 2 causas, la primera es por la desnaturalización de las proteínas, y la segunda por la inhibición de la síntesis de novo de proteínas a causa de las especies oxigénicas reactivas.
1.4. Procesos asociados a la fluorescencia clorofílica.
A consecuencia de los ajustes fisiológicos que ocurren en la planta, se pueden medir la fluorescencia clorofílica como una derivada del estrés por calor, entre los cambios que ocurren en la planta asociados a ella, se pueden mencionar una estimulación de la reducción oscura de la plastoquinona, y un aumento del flujo cíclico de electrones a la luz; también aumentan las fugas de electrones del tilacoide, se puede presentar una desactivación de la RUBISCO (Ribulosa 1,5 bi-fosfato-carboxilasa-oxigenasa), y la generación de especies oxigénicas reactivas tales como el O2* y el H2O2. En esta línea Sharkey (2005) señala que el Isopreno tiene la función de otorgar termo-tolerancia gracias a su acción sobre especies oxigénicas reactivas, indica que esta acción es muy rápida, pero tiene serias consecuencias sobre las reservas de carbono en plantas leñosas. También ocurren cambios en la composición lipídica de las membranas tilacoidales y el abastecimiento de isopreno, lo que tiene una importancia en la respuesta al estrés por calor (Sharkey, 2005), en este mismo sentido Ducruet et al. (2007) señala que la membrana tiene la capacidad de pasar de una membrana de tipo fluida líquido-cristalina a una sólida el tipo gel, esto genera cambios radicales en la permeabilidad de las membranas, lo que disminuye el intercambio iónico y tiene sus efectos en la fotosíntesis.
Una línea de investigación se ha desarrollado en el estudio de la actividad de las proteínas del shock térmico (HSPs), las cuales fueron tempranamente señaladas como responsables de las respuestas a diferentes tipos de estrés y especialmente en el estrés por calor (Kotak et al., 2007). En cuanto a la importancia de las HSPs o chaperonas, Sun et al. (2002) indican que la gran diversidad y su inusual cantidad dentro de los vegetales las hace parecer muy importantes, esto se refleja en la necesidad que tiene las plantas de adaptarse a distintos tipos de estrés, de hecho las HSPs son capaces de ensamblar, translocar y degradar muchas proteínas; estabilizan membranas y proteínas bajo condiciones de estrés (Wang et al., 2004). En este mismo caso Wang et al. (2004) señala que para las plantas es muy necesario mantener las conformaciones nativas de las proteínas, y que estas no se desnaturalicen, ya que así les permite a las células sobrevivir en condiciones de estrés.
Schrader et al. (2007) señalan que el pool de Ribulosa 1,5 bi-fosfato decae fuertemente cuando las plantas son sometidas rápidamente a un estrés por calor, pero que se puede recuperar si son mantenidas a dichas temperaturas, lo que puede indicar una desnaturación de la RUBISCO como respuesta al estrés, pero afirma que es un mecanismo para evitar el daño que este pueda generar, mediante producción de radicales libres por su actividad oxigenasa.
1.5. Medición de fluorescencia clorofílica.
“La base en la que se sustentan los análisis de la fluorescencia clorofílica es bastante sencilla” (Maxwell y Johnson, 2000) y señalan que medir la fluorescencia clorofílica permite entender el comportamiento del fotosistema II.
Los 3 procesos de disipación de la energía lumínica que llega a la hoja (Fotoquímico, calor, fluorescencia) ocurren en competencia entre sí, por tanto un aumento en un u otro va en detrimento de los restantes. Por ello la medición de la eficiencia de alguno de ellos entrega inmediatamente una idea del comportamiento de los otros procesos (Maxwell y Johnson, 2000).
Para realizar mediciones de fluorescencia clorofílica, Maxwell y Johnson (2000) señalan que se debe “apagar” un de los 2 mecanismos por los cuales se disipa energía en los sistemas fotosintéticos, principalmente se apaga el mecanismo fotoquímico a través del oscurecimiento del material fotosintético y de tal forma se desarticula todo el mecanismo de transporte de electrones que permite la realización de la fotosíntesis, esto sirve para determinar la máxima fluorescencia clorofílica (Fm) o en otras palabras, el mínimo rendimiento cuántico fotosintético (energía fotónica que puede ser almacenada como energía de enlace químico). La máxima fluorescencia clorofílica o máximo rendimiento de fluorescencia clorofílica (Fmáx) se obtiene al iluminar el material oscurecido, que no tendrá otra vía de disipación de energía más rápida que la fluorescencia. Luego de unos minutos, el sistema de transporte de electrones se restituye y el rendimiento de fluorescencia clorofílica llega a un mínimo estable (Fmín). La diferencia entre el Fmáx y el Fmín (Fv= Fmáx-Fmín) determina el rendimiento de fluorescencia variable o Fv. La gracia del Fv, como su nombre lo indica, es que es un valor que puede variar en el tiempo entre los 2 valores máximo y mínimo, según sean las condiciones en las que se encuentre el fotosistema II. Esta variación está determinada por el Fmáx, ya que dependiendo del nivel de estrés que tenga el fotosistema, este puede aumentar su índice, por aumento en los niveles de fluorescencia clorofílica (disipación de energía que compite con la eficiencia fotosintética). El rendimiento fotoquímico, rendimiento fotosintético o cuántico (Quantum yield) está determinado por la razón Fv/Fmax= (Fmax-Fmin)/Fmax, por lo tanto si aumenta Fmáx, el valor del rendimiento cuántico tendería a cero, reflejando una disminución en la eficiencia del rendimiento de la fotosíntesis. Según Maxwell y Johnson (2000), para la mayoría de las especies el valor óptimo de rendimiento cuántico es de 0,83 (un valor muy alejado de cero), y señalan que valores más bajos indican que las plantas han sido sometidas o han sufrido de forma natural algún tipo de estrés, especialmente por foto-inhibición o por algún daño en el fotosistema II (foto-oxidación).
La fluorescencia clorofílica es bastante pequeña en condiciones normales, y comprende entre 1 y 2% del total de luz absorbida (Maxwell y Johnson, 2000).
Al tener un espectro diferente la medición se puede realizar mediante la exposición de una hoja o tejido a cierta longitud de onda y cuantificar la luz re-emitida a una longitud de onda mayor, pero esta medición es sólo relativa porque siempre hay una pérdida de luz en el proceso de medición. La medición de la fluorescencia clorofílica se puede realizar mediante fluorímetros tanto en laboratorio, o en campo con los nuevos modelos portátiles (Maxwell y Johnson, 2000).
1.6. Cambios en la fluorescencia clorofílica.
Kautsky y sus colaboradores descubrieron que al exponer material fotosintético desde la oscuridad a la luz, este aumentaba de manera muy importante el rendimiento de fluorescencia clorofílica en periodos cortos de hasta 1s (Maxwell y Johnson, 2000). Maxwell y Johnson (2000) señalan que se debe a una disminución en los aceptores en la cadena de electrones, especialmente de las plastoquinonas, y de manera muy importante la plastoquinona QA. Esta tiene la capacidad de recibir los electrones de la fotólisis del agua y entregarlos uno por uno a la plastoquinona QB, para que continúe la cadena de electrones. Por lo tanto mientras la QA tenga asociado un electrón (reducida) estará en un estado “cerrado” y no recibirá otro electrón hasta que no traspase el primero, constituyéndose así, nuevamente en un estado “abierto”. Esto significa que un aumento en los estados cerrados de la plastoquinona A, permite una reducción en el rendimiento fotoquímico (fotosíntesis) y un aumento en el rendimiento no fotoquímico (fluorescencia clorofílica). Cuando las hojas están en un estado oscuro, sus aceptores de electrones quedan rápidamente en estados cerrados al ser expuestos a la luz, sin embargo este estado puede durar unos pocos minutos a causa de la producción de más aceptores y el concomitante aumento de la capacidad para llevar a cabo el proceso fotoquímico. Al aumentar el pool de plastoquinonas y de aceptores de electrones, y por la estimulación de la apertura estomática a través de la luz, lo que lleva a restituir el metabolismo de reducción fotoquímica del CO2. Otra razón está referida a un aumento de la disipación a través de la pérdida por calor.
2. El estrés en los vegetales superiores.
2.1. El estrés.
El estrés es cualquier factor que genera cambios a nivel bioquímico, fisiológico y molecular de manera negativa (Wang et al., 2004). El estrés puede tener 2 grandes orígenes, puede ser causado por organismos vivos, o bien, puede ser causado por factores ambientales no biológicos, en el primer caso se denomina estrés biótico, y en el segundo estrés abiótico. En este trabajo se habla sólo del segundo por estar más relacionado con la fluorescencia clorofílica
Las plantas al ser organismos inmóviles, están siempre expuestas a cambios bruscos en la temperatura y a otros factores abióticos constituyentes de estrés.
Wang et al. (2004) señala que tanto el estrés abiótico, como estrés hídrico, la salinidad, las altas temperaturas, la toxicidad química y el estrés oxidativo, son muy serios para la agricultura y también generan grandes daños al medio ambiente. Vinocur y Altman (2005) señalan que son las causas más importantes en las pérdidas de los cultivos a nivel mundial.
El estrés abiótico, causa principalmente una pérdida de la funcionalidad de las proteínas (Wang et al., 2004), esto se puede deber a la pérdida de la conformación nativa de las proteínas, aunque sea de forma momentánea, sea esto por cambios de pH o bien por cambios de temperatura.
2.2. El estrés por altas temperaturas.
Todos los organismos vivientes sienten estrés por altas temperaturas cuando la temperatura a la cual se exponen está por sobre el óptimo normal de su desarrollo (Kotak et al., 2007). Wahid y Close (2007) definen el estrés por calor como un aumento en la temperatura por un periodo determinado que es capaz de causar un daño irreversible en el desarrollo de la plantas.
El estrés por alta temperatura se presenta cuando una planta interrumpe su mecanismo más importante para la disipación del calor, esta es la vía de refrigeración transpiracional, esta se puede desarrollar por un evento de estrés hídrico (Sharkey, 2005), un cierre estomático que no permita transpirar u otro evento que altere esta vía, como el uso de herbicidas. Salvucci et al. (2004a,b,c) señala que las plantas con un adecuado acceso al agua, mantienen sus estomas abiertos, usando la refrigeración transpirativa para reducir la temperatura de sus hojas. De hecho, este mecanismo puede generar un diferencial de hasta 10ºC entre la temperatura del aire y la temperatura foliar en zonas calidas y semiáridas, siendo la temperatura del aire la superior. Sin embargo, afirma que esta capacidad de respuesta al estrés por calor se puede ver disminuida por una alta humedad relativa y por un deficiente proceso evaporativo (transpiracional), a causa de un estrés hídrico.
Las hojas de los vegetales son en su mayoría muy delgadas y aplanadas para aumentar la superficie de captación de fotones, sin embargo esta cualidad las hacer tener una mínima capacidad de calor propio, y con ello ser muy susceptibles a cambios bruscos del medio, por lo tanto, al quedar expuestas a toda la energía solar pueden sobrecalentarse de manera sustancial, por sobre la temperatura del aire. El uso de termocuples de alambre fino ha demostrado que con bajas tasas de transpiración las plantas sufren episodios frecuentes de alta temperatura en las hojas, la cual puede alcanzar hasta 15ºC por sobre la temperatura del aire (Sharkey, 2005) y las fluctuaciones pueden ser del orden de hasta 10ºC en 1s (Schrader et al., 2007). Sin embargo Allakhverdiev et al. (2008) señala que las alteraciones que el estrés por calor genere, va a depender del grado de desarrollo del órgano fotosintético, y resume que las hojas jóvenes y las más viejas responden de manera diferente al estrés por calor.
La fotosíntesis en uno de los procesos fisiológicos de los vegetales más sensible al estrés por altas temperaturas (Sage y Kubien, 2007; Zhang y Sharkey, 2009), el aparato fotosintético y la cadena transportadora de electrones son los principales blancos de estrés por temperatura, sea este por frío o calor (Ducruet et al., 2007). Según Allkhverdiev et al. (2008) hay tres procesos que se ven afectados por el estrés causado por altas temperaturas, siendo estos, los fotosistemas y el más importante es el fotosistema II, la generación de ATP y el proceso de asimilación de Carbono. Sin embargo Sharkey et al. (2005) señala que el estrés por calor moderado (35 a 40ºC) promueve un pequeño o nulo daño en el PSII, aunque afirma que la tasa fotosintética se puede reducir hasta cero. Esto se puede explicar porque según Pshybytko et al. (2008) el complejo oxidativo del agua se ve interrumpido, lo que genera que el transporte electrónico se detenga y la energía no puede ser almacenada como enlace químico, esto tiene su efecto en el centro de reacción y en los LHCs del fotosistema II.
La tasa de fotosíntesis aumenta progresivamente con la temperatura, hasta que alcanza un máximo, que representa la temperatura óptima de foto-asimilación, luego decae bruscamente por un estrés por alta temperatura, y antes del óptimo, la temperatura puede causar estrés por baja temperatura, incluso causar daño, o bien constituirse en una temperatura sub-óptima para la fotosíntesis, bajando la eficiencia de este proceso (Ducruet et al., 2007).
Taub et al. (2000) señala que las plantas creciendo en condiciones de mayor concentración de CO2 pueden tolerar de mejor forma el estrés por calor, tanto en condiciones de laboratorio como de campo.
2.3. La complejidad de la respuesta al estrés por altas temperaturas.
Las plantas en su evolución han desarrollado un sinnúmero de respuestas al estrés por altas temperaturas para evitar o minimizar el daño y asegurar la protección del equilibrio celular (Kotak et al., 2007). Los últimos estudios de las respuestas al estrés indican que la respuesta a los mismos es compleja, debido a que nunca una condición de estrés se encuentra por sí sola en condiciones de campo, por lo tanto, la respuesta no se puede asociar a sólo un factor, ya que, muchas de las respuestas son concordantes para más de una condición y no son exclusivas de solo una. Es así como la respuesta fisiológica y metabólica al estrés por altas temperaturas y al estrés hídrico es la misma (Mittler, 2006).
La RUBISCO cataliza los primeros pasos de 2 vías competitivas, la reducción del CO2 y la foto-respiración, las cuales están determinadas por la actividad carboxilasa y oxigenasa respectivamente (Salvucci et al., 2004a,b,c).
Sharkey (2005) señala que aún sin daño en el fotosistema debería esperarse que disminuya la eficiencia de la fotosíntesis debido a un aumento de la foto-respiración debido a un alza de la temperatura por sobre el óptimo para este proceso en cada especie. Pero aún no toda esta pérdida puede ser explicada por el efecto de la foto-respiración.
El daño en el fotosistema II se presenta sólo con temperaturas que superan los 45ºC, sin embargo estos daños son reversibles pero tienen su efecto detrimental sobre la tasa y por ende sobre la eficiencia fotosintética (Sharkey, 2005), y el daño sobre la fotosíntesis no es recuperable (Zhang y Sharkey, 2009). Este daño irreversible puede deberse al aumento en la actividad oxigenasa de la RUBISCO a altas temperaturas, que va en desmedro de la actividad carboxilasa, que permite la reducción del CO2 atmosférico (Schrader et al., 2007). En este sentido Salvucci et al. (2004a,b,c) declaran que la RUBISCO aumenta su capacidad catalítica, pero su afinidad con el CO2 va disminuyendo, disminuye también la solubilidad del CO2 en comparación a la solubilidad del O2 y aumenta su naturaleza oxigenasa, limitando así el posible aumento de fotosíntesis neta con el aumento de la temperatura.
El estrés moderado por calor reduce el metabolismo de los carbohidratos y el transporte electrónico en la fotosíntesis. (Zhang y Sharkey, 2009).
3. Las plantas frutales.
3.1. Plantas frutales y su origen.
Los vegetales, y por ende los árboles frutales, tienen un dominio de temperatura óptima dependiendo de su zona de origen, la adaptación a largo plazo va generando la aparición de ecotipos que de alguna manera toleran o resisten temperaturas más frías o más cálidas en comparación a sus parentales (Ducruet et al., 2007).
Para describir las especies según su origen en cuanto a la temperatura y el comportamiento de las mismas a esta variable, Ducruet et al. (2007) define 5 dominios: Dominio frío (1 a 18ºC), Dominio de temperatura óptima (18 a 30ºC), Zona cálida (30 a 40ºC), Dominio del estrés por calor (40 a 60ºC), Dominio de la temperatura muy alta (sobre 60ºC). La mayoría de las especies frutales de origen tropical o subtropical, se ven dañadas o incluso pueden morir en el dominio frío, precisamente por no ser resistentes a las bajas temperaturas. En el dominio de temperatura óptima, las plantas se pueden ver enfrentadas a un estrés particular, que para este caso el autor señala a la foto-inhibición como aquel punto crítico, además indica que en este dominio las plantas alcanzan su máximo rendimiento fotosintético (quantum yield). Para el caso de la zona cálida, uno de los factores determinantes de estrés es la disminución de la asimilación de Carbono, derivado del decrecimiento de la afinidad de la RUBISCO con este sustrato (CO2), y el aumento de su actividad oxigenasa, que genera especies oxígeno reactivas, además ocurren importantes cambios en la membrana del tilacoide con efectos en su permeabilidad, es aquí donde comienza a aumentar la fluorescencia clorofílica, y donde se manifiestan los primeros índices de daño por estrés generado por altas temperaturas. En el dominio de estrés por calor, como su nombre lo indica, es en el cual derechamente las plantas sufren daños por este factor y es en el cual las plantas están constantemente sometidas a los perjuicios mencionados, antes que se relacionan a la fluorescencia clorofílica. Y en el dominio de muy altas temperaturas, son pocas las especies del reino vegetal que pueden desenvolverse con algún grado aceptable, sin embargo a estas temperaturas, la mayoría de las plantas presentan severos daños a nivel de la membrana del tilacoide, que se hace imposible realizar fotosíntesis, y por ende vivir y producir.
3.2. Importancia de la temperatura en las especies frutales.
La fisiología, la distribución y la productividad de las plantas, incluidas las frutales, está controlada principalmente por la temperatura, teniendo esta importantes efectos en la actividad fisiológica en todas las escalas espacio-temporal (Sage y Kubien, 2007). Taub et al. (2000) agregan que es responsable de restricciones en el crecimiento, y que con el proceso del cambio climático, las plantas se verán expuestas a eventos de estrés por calor con mayores frecuencias, ya sea en ambientes naturales como en agro-ecosistemas.
Las plantas C3 (incluyendo las frutales) muestran una temperatura óptima de fotosíntesis que va desde los 20ºC a los 35ºC, con un máximo de asimilación de carbono con una temperatura por debajo de los 30ºC (Schrader et al., 2007).
En el mundo grandes pérdidas en el ámbito agrícola, se pueden atribuir al estrés por altas temperaturas en los cultivos, sobre todo si están acompañados de sequía u otros factores determinantes de estrés (Vinocur y Altman, 2005; Mittler, 2006; Kotak et al., 2007). El estrés por altas temperaturas es considerado uno de los principales factores de estrés que afecta la producción de biomasa y la productividad, tanto es países tropicales, como aquellos subtropicales y cálidos (Allakhverdied et al., 2008). Sharkey (2005) señala que por cada grado Celsius aumentado en la temperatura media de la temporada de crecimiento resulta en un decrecimiento de los rendimientos en un valor aproximado de 17%.
La inhibición de la fotosíntesis a causa del estrés por calor es común para los cultivos en zonas tropicales y subtropicales, y es experimentada periódicamente en las zonas más cálidas (Salvucci et al., 2004a,b,c). El estrés abiótico es la principal causa de pérdidas en la agricultura a nivel mundial, constituyendo pérdidas que pueden alcanzar hasta un 50% de la producción o incluso mucho más (Wang et al., 2004).
La temperatura de la hoja, en las condiciones naturales de ambiente y por lo mismo también en condiciones agroambientales, varía durante el día, de un día a otro en incluso varía dentro de la ubicación que tenga la hoja en la planta y el grado de exposición que tenga esta a la luz (Hüve et al., 2006).
Saakov (2001) señala que existe una depresión en la tasa de asimilación de CO2 al medio día, derivado de las altas temperaturas, además afirma que esto no sólo ocurre en plantas en condiciones de ambientes desérticos, sino que es muy importante en especies que se desarrollan es áreas en donde los veranos son muy calurosos. Además este autor señala que si las plantas son sometidas a temperaturas superiores a 35ºC (óptima para la fotosíntesis) la capacidad fotosintética se ve afectada hasta un 80%, y va más allá diciendo que una vez restituido el sistema, la planta queda a una capacidad del 70% de la que poseía previo a la situación de estrés.
Mittler (2006) realizó una matriz (stress matrix) donde relacionó los diferentes factores que pueden ofrecer algún grado de estrés a las plantas, y observó que desde el punto de vista agrícola, el estrés por calor tiene una alta importancia al combinarse con estrés por salinidad, estrés hídrico, el ozono atmosférico, los patógenos y la radiación ultravioleta, mientras que con las del daño por heladas o por frío (bajas temperaturas) no tiene importancia, dado que no ocurren de modo simultáneo, y no queda clara la importancia de su combinación con el déficit de nutrientes que pueda existir.
3.3. La domesticación y sus problemas
Las culturas nacen o se forjan a través del surgimiento de la agricultura. El hombre por miles de años ha ido seleccionando los animales y plantas de acuerdo a sus propias necesidades (alimento, abrigo, madera, etc.). Por lo tanto el problema de la domesticación siempre ha existido y seguirá estando presente. Poder domesticar una especie significa seleccionar el mejor material para que se adapte a las nuevas condiciones de crecimiento y de desarrollo, y darle las condiciones mejores para su desarrollo. En el caso de las plantas frutales los ciclos de vida son más largos y los procesos de mejora varietal duran mucho tiempo, por lo tanto, se hace necesario poder medir el daño que se genera en una especie al cambiarla de su lugar de origen, con el fin último de determinar manejos culturales que permitan a la especie responder de la mejor manera posible, para obtener los beneficios esperados.
4. Comprensión del uso de la fluorescencia clorofílica como indicador de estrés por altas temperaturas en las plantas frutales.
4.1. La fluorescencia como indicador de estrés
Importante es reconocer que la fluorescencia clorofílica entrega información acerca del estado del fotosistema II (Maxwell y Johnson, 2000). Cambios en la fluorescencia indican no sólo cambios en el estado del fotosistema, sino que también se relaciona por extrapolación con otros eventos que ocurren de manera simultánea que claramente indican el padecimiento de algún tipo de estrés (Ver apartado 1.4).
4.2. Adaptación al estrés por calor.
A corto plazo las plantas tienen la capacidad de adaptarse o aclimatarse a las temperaturas (Ducruet et al., 2007). Wang et al. (2004) señala que la adaptación al estrés involucra una serie de mecanismos de respuestas al estrés, que actúan de manera coordinada e incluso sinérgica, para evitar el daño o bien para restituir el funcionamiento celular. Las HSPs juegan un papel fundamental, tanto en condiciones normales de crecimiento y desarrollo, como en condiciones de estrés.
Pshybytko et al. (2008) señala que mientras más complejos es el sistema de respuesta al estrés, el individuo tiene mayores posibilidades de adaptación a condiciones de estrés en el aparato fotosintético y en la protección de específica del fotosistema II. Esto deja de manifiesto la importancia que tiene en los vegetales la diversidad de las proteínas HSPs.
Kotak et al. (2007) señala que la principal vía de adaptación en la evolución de los vegetales, se ha forjado a través de la conservación y diversificación de las proteínas HSPs, de las cuales existen grupos de ubicación o acción a nivel citosólico, nuclear, mitocondrial, cloroplástico, a nivel del retículo endoplasmático rugoso, etc. cada una de las cuales ayuda a proteger de manera individual o sinérgica a los diferentes organelos y compartimientos celulares. La conservación de estas proteínas se ha llevado a cabo a través de la conservación de factores de transcripción (HSFs), los cuales se activan una vez que la planta sufre algún tipo de estrés y particularmente un evento de estrés por altas temperaturas. La función que cumplen estas proteínas es evitar el daño a la conformación nativa de las proteínas y enzimas para que la planta no pierda su actividad fisiológica, por otra parte son capaces de renaturalizar las proteínas que han perdido su estructura cuaternaria, de modo de poder recuperar en parte el daño provocado por el estrés. Hüve et al. (2006) señala por su parte que el poder de adaptación de las plantas está centrado en poder responder de manera óptima a la temperatura media a la cual están expuestos durante un periodo determinando, dejando en claro que, bajo ninguna circunstancia, las plantas se van a adaptar a la máxima temperatura a la que ellas se vean enfrentadas. Esto, según lo hasta ahora analizado, sería muy fácil de entender, ya que, si se adaptaran a poder resistir a temperaturas mayores a la media, estarían exigiéndole a todo su aparataje enzimático y proteico responder a temperaturas mayores, lo cual no es una ventaja desde un punto de vista de la cinética enzimática. Este mismo autor señala que, una forma más eficiente para la planta es utilizar el ciclo de las xantofilas para cambiar la rigidez de las membranas y permitir a las células ser más o menos permeables según sea su necesidad frente a la temperatura ambiental.
Hüve et al. (2006) señala que un cambio en la concentración de azúcares también genera una mayor resistencia al estrés, lo que se puede relacionar a lo indicado por Zhang y Sharkey (2009), quienes observaron un patrón de cambio en el metabolismo del carbono. Y en parte esta discusión puede dar luces de la posibilidad que tiene el cloroplasto de almacenar grandes cantidades de almidón. Se puede decir que estaría allí a modo de quedar fácilmente disponible frente a un shock térmico, que incitaría a las células a perder agua para activar la refrigeración evaporativa, sin embargo no se puede perder toda el agua, porque podría haber plasmólisis si va acompañado de estrés hídrico (es usual que así sea) (Mittler, 2006). Por lo tanto este carbono podría utilizarse para poder generar solutos compatibles que permitan ligar mucha más agua a la célula en situaciones de estrés. De lo contrario Mittler (2006) señala que de ocurrir un evento de estrés hídrico y estrés por calor, implica un cierre estomático, un aumento en la temperatura foliar, una perdida de capacidad fotosintética y una alta foto-respiración.
La capacidad de recuperación del daño del fotosistema II es para Allakhverdiev et al. (2008) la base para la aclimatación que pueden presentar las plantas bajo condiciones de estrés. Este mismo autor señala que existen seis factores importantes en la tolerancia al estrés por calor, enumerando los siguientes: HSPs, antioxidantes, lípidos insaturados de membranas, la estabilidad de las proteínas al calor y la acumulación de solutos. Sin embargo para Vinocur y Altman (2005) la adaptación al estrés está dada por las cascadas de redes de reacciones en la percepción, la transducción de la señal, y la expresión de genes y metabolitos específicos relacionados con el estrés.
4.3. La fluorescencia y la fruticultura.
En este apartado se discutirá la aplicación que puede tener en la fruticultura el uso de la medición de la fluorescencia clorofílica en relación a la información que entrega de la condición de estrés por calor. Ya quedó clara la relación entre la fluorescencia clorofílica y la fotosíntesis, también se señalaron los complejos procesos que ocurren al aumentar la temperatura que conlleva a una mayor fluorescencia. Así, quedan relacionadas las mediciones de fluorescencia con los diferentes daños que se puede deducir, están ocurriendo en la planta a través del aumento de la fluorescencia con la temperatura. El conocer que hay aumentos en fluorescencia indica que hay estrés y que la producción en último término se está viendo desfavorecida. En la fruticultura, como en todas las áreas de la agricultura, no se desea tener plantas estresadas, ya que, eso significa plantas que no están expresando su máxima productividad. Las plantas al no expresar su máxima productividad, llevan a que en los cultivos se obtengan bajos rendimientos, lo que determina menores ingresos por unidad de superficie. Por lo tanto cada vez que aumente la fluorescencia uno puede pensar en una disminución de la eficiencia económico-productiva del sistema en análisis. Esto es muy importante, en la búsqueda de nuevas tecnologías de manejo de huertos, que permitan disminuir el daño generado por el exceso de calor.
Conclusiones.
El uso de la fluorescencia clorofílica como indicador de estrés permite tener una visión del estado en que se encuentra el fotosistema II, por lo tanto se deriva de ello, la capacidad a la cual la planta como un todo está respondiendo en términos de asimilación fotosintética.
Una planta con buenos indicadores de fluorescencia clorofílica (cercanos a 0,83) significa que es una planta que está libre de estrés en su fotosistema. Una planta que trabaja al nivel máximo con sus fotosistemas, es una planta que puede tener un rendimiento cuántico óptimo. Con un rendimiento cuántico óptimo, las plantas pueden satisfacer fácilmente sus necesidades de foto-asimilados y realizar una partición menos ajustada, con lo cual se asegura que ningún fruto, ni ninguna estructura quedarán en condiciones sub-óptimas. Las mediciones de fluorescencia clorofílica, en su último fin, miden al grado de foto-inhibición en el cual están las plantas, por lo tanto el grado de estrés que padece. La utilidad de este indicador puede ser, utilizarlo para buscar manejos mediante los cuales se logre minimizar el daño en aquellos días en que tanto la radiación, el abastecimiento hídrico y la temperatura sean limitantes, esto es de vital importancia para la fruticultura de que se desarrolla en climas de tipo mediterráneo, semi-desértico e incluso en climas tropicales. Esta técnica, permitirá determinar la temperatura óptima de fotosíntesis de todas las especies, el nivel de luz (PAR) que se necesita para tener un fotosistema no estresado, pero en su máximo rendimiento cuántico. En fin, se puede utilizar con fines investigativos, pero el aporte que entrega para un mejor desempeño de las plantas es de muy alto valor, ya que muchas veces es fácil determinar cuando las especies producen o vegetan mal en condiciones de estrés más comunes y conocidas (estrés hídrico, déficit de nutrientes, pH, toxicidad química, etc.), sin embargo, existen muchas situaciones, en donde estos factores están manejados bien e incluso así no se logran producciones óptimas. A futuro, no se puede dudar que el uso de tecnología de percepción remota y de posicionamiento global, dará la posibilidad de generar imágenes bidimensionales de los huertos y de los ecosistemas naturales, y el uso de estas tecnologías, en la mayoría de los casos, se relaciona con la emisión de fluorescencia por parte de los elementos investigados. Por lo tanto, hoy es necesario entender como se puede utilizar la referencia del estado del fotosistema que entrega la fluorescencia clorofílica, para poder desarrollar mejores diseños y manejos de los huertos. Mañana, será posible recibir esta tecnología en tiempo real, mediante ordenador y poder estimar día a día el efecto del estrés por foto-inhibición mientras ocurre, ya sea por exceso de luz, temperatura o déficit hídrico.
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